FDA 규정 준수를 위한 생체시료 분석법의 개발, 검증 및 시료의 분석  [3끝]

미국과 국내에서 regulated (GLP) bioanalysis CRO에서 근무한 경력을 통해 가지고 있는 경험과 지식을 바탕으로 "FDA 규정 준수를 위한 생체시료 분석법의 개발, 검증 및 시료의 분석(Bioanalytical method development, validation, and sample analysis for FDA compliance)"에 대해 요약적으로 기술하고자 한다. 국내에서 chromatographic calibration (cc) 및 ligand binding assay (LBA), 그리고 이와 관련하는 분야에서 종사하는 업계관계자들께, FDA가 중요하게 간주하는 사항들뿐만 아니라, 미국과 국내 간 차이와 더불어 국내의 일부에서 부적절하게 인식하고 실시하는 사례 몇 가지도 소개함으로써 신뢰성이 보장된 실제시료 분석 결과의 보고 (analytical report)가 Sponsor와 FDA에 성공적으로 제출되고 통과되는데 도움이 되고자 한다. 3회에 걸쳐 연재한다.

실제시료의 분석은, 사전에 온전히 검증된 (정확성을 보장하는) 분석법을 사용하여 실제시료의 미지농도 (unknown concentration)를 결정함을 목적으로 하며, 무결성의 신뢰할 수 있는 즉, 희석재분석을 포함한 어떠한 재분석과 분석실행의 실패도 없으며 분석의 반복성 (assay repeatability)을 평가하는 incurred sample reassay (ISR)를 완벽하게 통과함을 목표로 한다. 

실제 시료를 희석하여 재분석할 때, 검증 시 10배까지 정확성을 평가하였다면 이를 실제시료에 적용 시 적어도 그 배수를 초과하지 않도록 한다. 무엇보다도 실제시료에 대해 희석재분석 하지 않도록 그 농도의 범위를 사전에 적절하게 결정하는 것이 중요하나, 그럼에도 불구하고 희석 재분석이 불가피하다면 그 재분석하는 실제시료의 개수는 최대 십수개를 초과하지 않도록 최소화하여야 할 것이다. 

재분석은 원칙적으로 엄격하게 금지된다. 명백한 에러 즉, 사전에 (데이터프로세싱 전) 인지되고 기록된 에러임에 따라 재분석 이전에 이미 오리지널 데이터 (original data, 초검데이터는 부적절한 표현임)가 아니라 재분석 데이터를 보고하는 것으로 결정이 된 경우에 대해 재분석하는 것이 타당하다. 명백한 에러의 예로서, human error 즉, preparation error (e.g., standard working solution unspiking or double spiking)와 processing error (e.g., internal standard unspiking or double spiking), 기기에러 (instrumental error), 주입에러 (injection error), 실행의 실패 (run fail), aberrant result 중 하나로서 predose에서 LLOQ 이상 검출 등을 들 수 있으며 이러한 에러에 의한 재분석조차도 최소화되어야 할 것이다.

이에 반해 예를 들어 kinetics (plot of concentration vs. time)의 검토로부터 또는 washout 후 (두번째) predose에서 LLOQ 이상의 검출 등과 같은 경우에 대한 재분석은 제한되어야 할 것이다 (Sponsor request 예외). 명백한 에러가 아닌 사유로 인해 즉, 재분석 전에 이미 오리지널 데이터는 제외하고 재분석 데이터를 보고하기로 결정된 경우에 해당되지 않을 때, 재분석 후 오리지널 데이터와 재분석 데이터를 비교하여 그 차이 (difference)가 허용범위 이내면 (within the acceptable range) 오리지널을 최종 데이터로 결정하여 보고하고, 허용범위 밖이면 (outside the acceptable range) 추가로 재분석을 실시 한 후 얻는 총 3개 데이터를 비교로부터 보고할 최종 데이터를 결정하되, 이 때 결정하는 기준 (criteria)는 과학적이고 정당한 판단 (scientific and justifiable judgments)을 기반으로 하여야 한다. 

바람직하지 않는 재분석 사례 중 하나로서, 하나의 실행에서 각 실제시료의 내부표준물질 면적 (internal standard peak area)을 QCs의 그것의 평균으로부터 +/-50% 벗어나면 해당 실제시료를 재분석함을 들 수 있다 (internal standard 미투입과 중복투입으로 인해 각각 no IS detected 및 double IS detected일 때는 예외). Internal standard는 비단 처리된 시료의 기기분석뿐만 아니라, 시료의 처리 단계에서 발생하는 분석물질의 변동 (variation)까지도 보정함 (correction)을 목적으로 하기 때문에 온전히 검증된 분석법을 이용하여 얻은 실제시료의 데이터에서 internal standard (IS)로서 stable isotope-labeled analyte에 대해 변동이 관찰되었다는 것은 IS가 그 역할을 충실히 하였음을 의미한다. 따라서 +/-50%를 재분석의 기준으로 하기 보다는, 실제시료 중 analyte peak area (signal-to-noise)를 low QCs와 high QCs의 peak area (signal-to-noise)와 비교하여 underestimation 또는 overestimation 가능성을 조사한 후 이를 바탕으로 재분석 여부를 결정하는 것이 타당하다.

한편, IS가 SIL analyte이 아니라면, 비록 검증 시 선택성과 매트릭스가 실제시료의 대리 (surrogate)인 QCs의 정확성에 영향을 주지 않음을 확인하였다 하더라도 실제시료 분석에 대해서도 반드시 정확성을 보장하지는 않기 때문에 실제시료 분석 시 IS 변동이 관찰되지 않았음뿐만 아니라 관찰되었음에 대해서도 사실상 IS가 분석물질의 변동을 보정하는 역할을 충실히 이행하였다고 확신할 수 없음을 유의하여야 할 것이다. 

Incurred sample reassay (ISR)는, 실제시료 분석 시 각 실행 (run)에서 구축되어 적용된 다수의 calibration standard curve equation들을 ISR에서 구축되어 적용된 하나의 calibration standard curve equation와 비교함으로써 각 실제시료 분석의 반복성 (repeatability)뿐만 아니라 실제시료 분석의 run-to-run variation을 통한 일관성 (consistency)도 확인하고자 함을 목적으로 한다. 따라서 ISR 시료들 각각에 대해 오리지널과의 차이 (difference)보다는, ISR 실행내에서 그 차이들의 추세를 검토하고 평가하는 것이 더 중요하기 때문에 하나의 실행을 통해 ISR을 실시하는 것이 바람직하다.

불가피하게 ISR 시료 수가 지나치게 많음 또는 실제시료 보관안정성의 제한 등으로 인해 불가피하게 2개 이상의 ISR 실행을 실시하는 경우에는 calibration standard curve의 ISR run-to-run variation을 최소화하는 것이 중요할 것이며 이를 위한 예로서, 동일한 로트 (lot)의 QCs를 서로 다른 ISR 실행에 걸쳐 적용함 또는 QCs의 lot-to-lot variation의 control 등을 들 수 있다. QCs를 실제시료와 같이 보관, 해동, 처리하지 않고 calibration standards처럼 모든 각각의 분석실행마다 새롭게 조제하여 실제시료와 함께 처리하는 경우에는 ISR 결과의 검토를 바탕으로 이러한 방식이 실제시료 분석의 정확성에 끼칠 수 있는 영향을 조사하는 것이 중요하다.

예를 들어 비록 ISR 허용기준을 충족하였으나 특정 분석실행의 ISR이 전체 ISR의 trend로부터 벗어나는 경우 등을 들 수 있다. 

Data processing method에는 calibration standard curve construction을 위한 parameter로서 regression type과 weighting type 등이 포함되며, peak integration을 위한 parameter로서 smooth, baseline, range 등과 같은 parameter가 포함된다. 검증에서 한번 결정된 method는 원칙적으로 마지막 실제시료 분석 (ISR 포함)에 이르기까지 변경되지 않아야 한다. 만일 그 변경이 불가피하다면 그 변경은 정당한 사유를 바탕으로 하여야 하며 변경이 다시 검증부터 분석까지 얻은 모든 데이터에 대해 적용됨으로써 적어도 그 일관성을 유지하여야 한다. 유의 사항으로서, 적어도 실제시료와 동등하게 조제, 보관, 해동, 처리, 및 분석된 QCs가 허용기준을 충족함으로써 해당 실행이 통과하였다면, 분석실행들 사이에서 calibration standard curve의 기울기와 y축의 절편의 variation이 실행의 통과 또는 실패 (run pass or fail)를 결정하지 않는다. 

개발은 신속하고 정확하게 에러 없는 검증이 이루어지는 것을 목표로 디자인되고 이에 따라 실시되어야 하며, 검증은 실제시료의 정확한 분석에 대한 신뢰성을 실제적으로 보장할 수 있도록 즉, 모든 각각의 분석실행에서 에러와 이슈 (재분석과 ISR) 발생하지 않는 것을 목표로 디자인되고 이에 따라 실시되어야 할 것이다. 실제시료의 분석 시, 어떠한 분석실행 (analytical run)도 실패 없이 보고하는 것이 중요하다.

특히 명백한 에러 (e.g., human or instrumental error)뿐만 아니라 그 실패의 원인이 불분명한 실행실패 (fun fail)가 발생하지 않도록 하며 만일 2회 이상 연속하여 발생하는 경우 실제시료 분석을 중단하고 원인을 규명하여 해결한 후 분석의 검증을 다시 하여야 할 것이다.

신뢰성을 훼손하지 않도록 scientific and justifiable judgments를 기반으로 재분석 기준을 세우고 이를 실제시료 분석에 일관되게 적용하여야 할 것이다. 신뢰성이 보장된 실제시료 분석 결과의 보고는 Sponsor와 FDA에 빠르고 원활하게 제출되고 통과될 것이다.