FDA 규정 준수를 위한 생체시료 분석법의 개발, 검증 및 시료의 분석    [1]

미국과 국내에서 regulated (GLP) bioanalysis CRO에서 근무한 경력을 통해 가지고 있는 경험과 지식을 바탕으로 "FDA 규정 준수를 위한 생체시료 분석법의 개발, 검증 및 시료의 분석(Bioanalytical method development, validation, and sample analysis for FDA compliance)"에 대해 요약적으로 기술하고자 한다. 국내에서 chromatographic calibration (cc) 및 ligand binding assay (LBA), 그리고 이와 관련하는 분야에서 종사하는 업계관계자들께, FDA가 중요하게 간주하는 사항들뿐만 아니라, 미국과 국내 간 차이와 더불어 국내의 일부에서 부적절하게 인식하고 실시하는 사례 몇 가지도 소개함으로써 신뢰성이 보장된 실제시료 분석 결과의 보고 (analytical report)가 Sponsor와 FDA에 성공적으로 제출되고 통과되는데 도움이 되고자 한다. 3회에 걸쳐 연재한다.

시료분석의 결과에 대해 무엇보다도 accuracy를 보장하는 것이 중요하다. 그러나 시료분석으로부터 accuracy를 직접 평가하는 것은 불가능한데 그 이유는, 미지의 실제시험시료 (unknown, real study sample)로부터 측정되는 데이터 (observed data) 외에 accuracy를 계산하기 위해 필요한 expected (known) value를 결정할 수 없기 때문이다. 또한, 실제시료를 가지고 실시하는 incurred sample reanalysis (ISR)로부터 분석의 accuracy를 평가하는 것 역시 불가능하다. ISR로부터 평가할 수 있는 것은, 실제시료 분석에 이용된 분석법이 가지는 데이터에 대한 반복성 (repeatability)이다. 

시료분석에 이용된 분석법이 허용기준을 충족할 만큼의 정확한 시료분석데이터를 생산함을 보장하기 위해서는, 인위적으로 조제 (preparation)함으로써 expected data를 가질 수 있는 시료인 인공시료 중 하나로서의 품질관리시료 (quality controls, QCs)가 필요하며, 이를 실제시료와 함께 나란히 보관 (storage), 처리 (processing) 및 기기분석 (instrumental analysis)하여 얻는 observed data로부터 실제시료 분석에 적용된 분석법의 accuracy를 평가하고 이를 바탕으로 실제시료 분석의 신뢰성을 보장한다. 따라서 실제시료와 비교할 때 비록 QCs를 완전히 동일하게 preparation, storage, processing, instrumental analysis하는 것은 불가능할 것이나 적어도 최대한 동등(유사)하게 함으로써 QCs가 실제시료를 최대한 대리 (surrogate)하도록 하는 것이 매우 중요하다. 실제시료와 QCs 간의 동등한 조제로서, 흔히 종 (species)과 시료의 형태 (type, e.g., plasma), 항응고제 (anticoagulant)를 일치시키는 것만으로는 충분하지 않는 경우가 많다.

예를 들어, 아래와 같은 불일치 (unmatching)의 경우, 실제시료와 나란히 QCs를 storage, processing, instrumental analysis한 후 얻는 그 데이터가 정확성을 보인다 하더라도 (i.e., QCs meet the acceptance criteria) 실제시료 데이터의 신뢰성을 보장하지 않으며 또한 ISR의 부실한 (poor) 결과 또는 실패 (fail)로 이어질 수 있다.

① 분석물질 (analyte, parent drug) 외에 대사체 (metabolites)도 포함되어 있는 실제시료의 storage, processing, instrumental analysis 과정에서 metabolites가 parent drug로 역전환 (back-conversion)하는 데 비해, 조제된 QCs에는 오직 parent drug만 포함하고 있을 때 

② 실제시료에는 캡슐화된 약물 (encapsuled drug)이 포함되어 있으나, 조제된 QCs에는 오직 약물 (unencapsuled drug)만 포함하고 있을 때

③ 실제시료 중 분석대상은 단백질이나, 조제된 QCs에는 그 단백질이 아닌 단백질 구조의 일부로서인 펩타이드를 포함하고 있을 때 

④ 분석물질이 아닌 chemical derivative를 포함하여 조제된 시료를 QCs로 사용할 때 

⑤QCs 조제 시 허용한계 이상의 부피비 (> 1%, v/v)로 분석물질용액 (analyte standard working solution)을 공매트릭스 (blank matrix)에 투입함으로인해 분석물질의 안정성과 처리거동 (stability and processing behavior)가 실제시료의 그것과는 차이를 보일 때 등이다.

만일 실제시료 분석 시 위와 같은 실제시료와 QCs 사이에서 unmatching이 불가피하다면, 그러한 unmatching이 실제시료 분석의 정확성 (신뢰성)에 끼치는 영향을 조사하고 영향 없음을 보장 (자료 제출)하여야 할 것이다.

Calibration standard curve가 아니라, QCs가 실제시료의 농도들을 포괄하여야 함 (The QCs should cover the expected study sample concentration range: study samples should always be bracketed by QCs)을 유의한다. 또한 QCs의 한 농도와 또다른 농도 간의, 산술적 차이가 아니라, 기하학적 차이들이 상호 유사하면서도 최대 원오더 (one-order)를 초과하지 않도록 함으로써 QCs가 실제시료 농도범위에 대해 고르게 분포하도록 한다.

실제시료와 같이 동등하게 QCs를 보관하기 위한 조건으로서, 비단 온도와 기간 (storage temperature and duration)뿐만 아니라, 보관용기(재질), 차광, 안정화제, 흡착방지제 등까지도 포함하는 것이 중요하다. 이와 같이 QCs를 이용한 안전성 조사와 평가 그리고 조치는, 신뢰할 수 있는 분석 검증과 이를 이용한 실제시료의 분석을 위해, 분석의 개발 단계에서 필수적으로 이루어져야 한다. 분석 시 실제시료의 형태가 plasma (or serum)이라 하더라도 그 안정성뿐만 아니라, 전혈 (whole blood)의 (단시간보관)안정성 평가도 빠뜨리지 않아야 한다. 만일 실제 whole blood 시료에 안정화제가 투입되었다면, 비록 실제혈장시료에는 안정화제가 투입되지 않았다 하더라도, 조제하는 QCs에는 동등한 농도의 안정화제를 포함함으로써, 실제시료와 QCs 사이에서 매트릭스매칭 (matrix-matching)하도록 하여야 한다. 실제 집뇨 (urine collection) 과정에서 집뇨백 중 약물의 흡착에 의한 분석의 부정확성이 종종 관찰되는데, 이러한 이슈를 방지하고자 흡착방지제를 투입하였다면 QCs에도 동등한 농도의 흡착방지제가 포함되도록 한다. 

분석이 복잡해지는 것을 방지하기 위해, 가급적 standard stock solution 또는 standard working solution 중에 안정화제 및 흡착방지제 등을 투입하여야 하는 경우를 피하는 것이 좋으나, 그럼에도 불구하고 불가피하였다면 이 solution을 투입함으로써 조제되는 QCs에 안정화제 및 흡착방지제가 포함됨에 따라, matrix-matching을 위해, 역으로 실제시험시료에도 동등한 농도의 안정화제 및 흡착방지제가 채혈 또는 집뇨 시 포함되도록 하여야 한다. 안정화제의 일종으로서 enzymatic inhibitors와 흡착방지제 일종으로서의 Triton X-100 등과 같이 비교적 위험도 (hazard)가 낮은 물질의 사용을 최우선으로 할 필요가 있는데 그 이유는, 해외 (미국, 유럽, 호주 등)의 경우 채혈 및 집뇨 단계에서 예를 들어, 포름산 (formic acid)수용액과 같은 물질이 그 조제와 더불어 실제시료에 투입하는 작업이 대부분 거부될 수 있기 때문이다. 따라서 분석의 개발 (assay development) 시, 이러한 이슈를 바탕으로 유관기관과의 사전 협의 후 분석의 검증 (assay validation)이 이루어져야 할 것이다.

실제시료와 QCs 간의 동등한 시료처리 (sample processing)를 위해 모든 각각의 분석실행 (analytical run)내에서 QCs가 실제시료와 함께 해동된 후 단계별로 (step-by-step) 함께 처리되어야 한다. 하나의 분석실행 내에서 실제시료 수의 최소 5% (또는 10%)에 해당하는 QCs 갯수를 포함하는 것뿐만 아니라, 시료처리의 순서에서 QCs 사이에 실제시료가 골고루 포함되도록 한다. 마찬가지로 instrumental analysis 순서에서도 QCs 사이에 실제시료가 골고루 포함되도록 하는데, 통상적으로 그 순서를 시료처리순서와 일치시킨다.

내부표준물질 (internal standard, IS)의 발굴과 적용은 분석의 신뢰성에 있어 결정적인 게임체인저 (game changer)가 된다. 단순히 instrumental analysis 단계뿐만 아니라 sample processing (extraction, reaction, filtering 등을 포함)의 단계를 거치면서 불가피하게 발생하는 분석물질 (analyte)의 변동 (variation)이 정확성에 끼치는 영향을 허용범위 이내까지 최소화하기 위해 냉동보관된 실제시료와 QCs의 해동 (thaw)직후와 sample processing 직전사이에 IS를 투입한다. 따라서 IS로서 분석물질이 가지는 처리의 거동 (processing behavior), 크로마토그래피 거동 (chromatographic behavior), electrospray ionization behavior (이온화 거동), 질량분석의 거동 (mass spectrometric behavior)에 대해 동등한 거동 (behavior)을 가지는 물질을 결정하는 것이 매우 중요하며 이 때, stable isotope-labeled (SIL) analyte가 analyte와 가장 유사한 behavior를 가진다. 비록 권장되지는 않으나 신약개발초기에는 SIL이 아닌, analyte와 구조적으로 유사물질인 analogue 또는 similarly chromatographic behavior를 가지는 물질을 IS로서 사용하기도 하는데 이 때 얻은 실제시료들의 데이터를 활용할 때 그 데이터가 추후 SIL 적용을 통해 얻을 데이터와의 비교로부터 상당한 차이를 가질 수 있는 가능성을 포함하는 것이 필수적이다. SIL의 경우, analyte와 최대한 동등한 거동을 가지도록 하기위해 최대한 적게 labeling하면서도 analyte에 대해 mass spectrometric interference 이슈를 야기하지 않도록 하는 것도 중요하다. 동시에 역으로, 과도한 labeling으로인해 비록 mass spectrometric interference 이슈는 피하였으나 대신, processing behavior, chromatographic behavior에서 analyte와 상당한 차이를 보이지 않도록 하는 것이 필요하다. 더불어 mass spectrometric cross-talk이 관찰되지 않도록 analyte의 분자구조 내에서 labeling 위치를 결정하는 것도 중요하다. 마지막으로, 실제시료와 QCs의 processing 과정에서, analyte와 IS가 각각 가지는 processing behavior의 상호 차이를 허용가능한 범위 이내로 (즉 accuracy를 보장하도록) 줄이기 위해 sample processing 전에 가급적 최소의 부피로 IS solution을 각 sample에 투입하여야 할 것이다.

Calibration standard curve는, 미지농도 (unknown concentration)를 가지는 실제시료의 측정농도 (observed concentration)와, 기지농도 (expected concentration)를 가지는 QCs의 측정농도 (observed concentration)를 계산하기 위한 수식 (즉, regression parameters, e.g., slope and y-intercept)을 제공한다. 따라서 calibration standard curve의 구축 (construction) 후 QCs를 조제하고, 이를 가지고 accuracy를 맞추는 것이 아니라, (실제시료와 유사하도록) 디자인하여 조제된 QCs에 대해 그 정확성이 평가 가능하도록 calibration standard curve가 구축되어야 한다.

QCs를 가지고 평가하는 시료분석의 정확성이 허용기준 (acceptance criteria)을 충족하는 한, calibration standard curve construction 즉, calibration standards에 대한 preparation, processing, instrumental analysis가 특정한 제한을 받는 것은 아니지만 통상적으로는, QCs와 동등하게 실시된다. 그러나 적어도 calibration standard는 (QCs와는 달리) 모든 각각의 analytical run에서 항상 새로 조제한 (preparation) 후 처리 (processing)가 이루어지도록 한다. Calibration standard curve가 반드시 linear regression이어야할 필요는 없으나, 적어도 quadratic regression과 같은 non-linear (비선형)의 적용이 실제시료 분석의 신뢰성에 영향을 끼치지 않음을 조사하고 보장하여야 한다. 따라서 실제시료를 대리 (surrogate)할 QCs의 조제가 calibration standard의 그것과 차이가 없다면 단순히 QCs가 그 허용기준을 통과하였음만으로는 실제시료에 대한 정확성을 보장하기에 불충분하다.

예를 들어 그러한 비선형이 sample processing, chromatographic separation, ionization, mass spectrometric 단계 중에 발생함 외에, QCs에 대한 standard solution preparation (조제) 과정에서도 발생함을 주의하여야 할 것이다. 이로 인한 QCs의 비선형은 실제시료를 반영하지 않을 것이기 때문에 (즉 실제시료 농도데이터를 신뢰할 수 없기 때문에) 반드시 standard solution preparation의 선형성을 확인하고 보장하거나 또는 QCs 자체의 조제방법을 변경함 등의 대책이 마련되어야 할 것이다. 또한 linear regression과 대비할 때 실제시료 분석에 적용되는 QCs의 concentration level 수를 늘릴 필요도 있을 것이다. [5일자 계속 계속]