"사이토카인 분석, 면역학적 검사의 중요 파라미터"

"의약품의 독성실험 기준에 언급되고 있지 않지만, 면역학적 검사의 중요한 파라미터(Parameter)로 '사이토카인(Cytokine) 분석'이 있습니다. 사이토카인 분석은 'ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)'와 'CBA(Cytokine Bead Array)'로 나뉩니다. ELISA는 실험 방법이 최대 24시간이 소요된다는 단점이 있습니다. CBA는 하나의 샘플로 동시 분석이 가능하지만, 별도의 키트를 구매하므로 비용이 발생합니다."

전영하 바이오톡스텍 첨단독성과장은 12일 바이오톡스텍ㆍ키프론바이오가 공동으로 주최한 신약 개발을 위한 비임상시험 심포지엄에서 '면역학적 검사의 최신 경향 및 실효성'을 주제로 발표하며, 사이토카인 분석에 대해 이같이 밝혔다.

면역학적 검사는 면역 시스템 상태를 평가하는데 사용되는 여러 종류의 검사를 뜻한다. 전 과장은 "면역세포란 외부에서 침입한 병원균, 이물질, 바이러스 등에 저항해 이겨낼 수 있도록 방어하는 세포"라며 "면역세포로 T세포, B세포, NK세포 등이 있다"고 말했다.

그는 면역학적 검사의 최신 경향에 대해 "의약품 등의 독성시험 기준(식품의약품안전처 고시 제2022-18호)에서 면역독성은 의도하지 않은 면역억제 또는 면역증강으로 정의한다"며 "면역독성시험의 항목으로 크게 6가지를 언급하고 있는데, 개정 전 △세포매개성 면역시험 △체액성 면역시험 △대식세포 기능시험 △자연살해세포 기능시험 시험 항목 등이 있었다. 2022년 개정본에 △면역표현형검사 △숙주저항능시험 등이 추가됐다"고 설명했다.

면역은 크게 '선천성 면역'과 '후천성 면역'으로 나뉘는데, 후천성 면역은 세포성 면역과 체액성 면역으로 나뉜다. 전 과장은 "세포 유약화시험에는 세포매개성 면역시험, 체액성 면역시험이 있다"며 "세포매개성 면역시험은 콘카나발린 A(Concanavalin A) 및 특이항원에 대한 세포 유약화시험이며, 체액성 면역시험은 지질다당류(LipopolysaccharideㆍLPS)에 대한 세포 유약화시험"이라고 말했다.

세포 유약화시험은 주로 비장을 사용하기 때문에 '비장 유약화시험'이라고 불린다. 전 과장은 "비장은 △가장 큰 보조 면역 장치 △가장 많은 면역세포를 포함 △T림프구 활성화 △B림프구 활성화 △후천면역 반응 개시 등 기능을 하는 주요 장기"라고 말했다.

그는 이어 "랫트 또는 마우스의 비장 세포를 이용해 시험관 내(In vitro)에서 비특이적인 증식 유도물질인 '마이토젠(Mitogen)'을 사용, T세포와 B세포 증식능을 유도하는 시험법이 있다"며 "흡광도를 측정해 대조군과 림프구 증식능을 비교할 수 있다"고 덧붙였다. LPS, 콘카나발린 A에 대한 병용 처리는 시료 처리에 대한 세포의 민감성을 증가시켜 세포활성 여부의 판단을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다.

그는 "면역표현형검사를 진행하기 위해서는 유세포분석기(Flow cytometer)가 꼭 필요하다. 회사에서는 최신 유세포분석기를 보유하고 있고, 현재 이 기기로 많은 실험을 진행하고 있다"며 "형광물질이 부착된 세포가 물줄기 속에서 흐르다가 레이저와 만나게 되면 두 가지의 중요한 물리적 현상이 발생한다. 우선 레이저와 만나게 되면 빛의 산란 현상이 일어난다. 또 형광물질에 대한 발광현상이 생긴다"고 했다.

전 과장은 형광염색 작업에 대해 "예를 들어 T림프구에 형광물질을 붙여 각각을 인식할 수 있는 형광항체를 이용해 분석을 하게 된다"며 "T세포는 CD3, B세포는 CD45R, NK세포는 CD49b를 붙이게 된다. 유세포분석기를 활용해 단백질의 발현도를 수치화해 분포도를 분석할 수 있다"고 강조했다.

마지막으로 그는 "면역 검사를 통해 얻을 수 있는 실효성으로 △규제 준수 △안전성 평가 △신약 개발 지속성 △약물 설계 개선 △부작용 예방 등이 있다"고 말했다.